具免疫調節作用的羊膜來源間質基質細胞在裘馨氏肌營養不良症小鼠模型中保存肌肉功能

主要要點與發現：

這是一項動物研究。沒有治療任何患者。一個由東京大學、日本醫科大學和Kaneka Corporation組成的日本團隊，對mdx小鼠（裘馨氏肌營養不良症的標準小鼠模型）反覆經尾靜脈注射人類羊膜來源間質基質細胞（hAMSC），並追蹤小鼠長達一年。

對考慮治療的家庭而言，這篇論文顯示：這些細胞在實驗室中透過把巨噬細胞推向抗炎的M2型來平靜免疫系統；小鼠能耐受重複的靜脈劑量，並且肌肉炎症減少；接受治療的小鼠在一年時握力保持得較好、跑得較遠，心臟功能也稍好。它沒有顯示這些情況會發生在兒童身上。這些細胞來自羊膜，不是我們自己方案所使用的臍帶來源細胞，而且它們沒有恢復肌失養蛋白，也就是導致疾病的缺失蛋白質。細胞由Kaneka Corporation提供，該公司部分資助了這項工作，並聘用其中四位作者。

目的：

測試hAMSC是否使人類巨噬細胞偏向M2型，以及在疾病早期反覆全身注射hAMSC，是否能改善mdx小鼠的骨骼肌和心肌功能。

方法：

細胞。 羊膜取自接受剖腹產的女性的胎膜，並經同意。細胞以酶消化分離，擴增、冷凍，並在第1至第5代之間使用。它們帶有常見的間質幹細胞標記（CD73、CD90、CD105），缺乏CD45、CD34、CD14、CD11b、CD19和HLA-DR，在培養中形成骨和軟骨，但不形成脂肪。

實驗室工作。 人類血液單核細胞與hAMSC以20比1共同培養，以流式細胞術和qPCR測量巨噬細胞標記，並使用吲哚美辛（indomethacin）阻斷前列腺素E2（PGE2）。

動物。 C57BL/10背景的雄性mdx小鼠被隨機分為對照組和治療組。每次劑量為8.0 × 10⁵個hAMSC，溶於100 µL生理食鹽水，經尾靜脈注射，每週一次，從4至5週齡開始。短期組接受四次劑量（n = 10，在12週齡和18週齡評估，對照為14隻對照mdx小鼠和7隻野生型小鼠）。長期組接受四次劑量（n = 6）或六次劑量（n = 4），在一歲時評估，對照為12隻對照mdx小鼠和7隻野生型小鼠。許多結果是在3至8隻小鼠的子集中測量的，詳見下文。預先設定的主要結果是長期運動功能（前肢握力和跑步速度）；組織學為次要結果。研究人員無法對小鼠品系設盲；跑步由自動跑輪在五天內記錄。當小鼠體重下降、受傷或衰弱，或數值被認為異常時，資料被排除。

結果：

培養皿中的免疫效應。 hAMSC把活化T細胞的增殖從90.1%降至59.9%（p低於0.0001），並分泌PGE2。CD206陽性（M2）細胞的比例小幅上升，從11.3%升至14.2%（p = 0.035），而M1細胞沒有變化。吲哚美辛消除了CD206的上升，顯示PGE2是介質。

耐受性。 治療組和未治療的mdx小鼠的體重在任何時間點都沒有差異。沒有報告其他安全性指標（器官檢查、腫瘤篩檢、對人類細胞的免疫反應）。

短期（12至18週齡，四次劑量）：

• 血清肌酸激酶（肌肉滲漏標記）在最後一次劑量四週後較低（435 ± 79對583 ± 92 ng/mL，p = 0.038，n = 6對4），但十週時沒有（582對700 ng/mL，p = 0.228）。作者稱之為暫時性。
• 脛前肌中的IL-6：10.0 ± 3.8對94.2 ± 64.1 pg/mL（p = 0.002，n = 4對5）。
• 12週時的握力：336.8 ± 21.0 g對280.0 ± 37.8 g（p = 0.0008；以體重標準化為10.3對8.8 g/g，p = 0.012；n = 10對14）。
• 橫膈中的巨噬細胞（F4/80）面積：14.0%對19.5%（p = 0.013，n = 4對3）。脛前肌中帶有M2標記CD206的巨噬細胞比例從17.6%升至55.5%（p低於0.0001）。
• 治療四週後在脛前肌中發現了人類細胞，只占切片面積的0.0036%，到第十週已經消失。沒有檢測到肌失養蛋白，因此這些細胞沒有修復根本的缺陷。

長期（一歲，四次或六次劑量，通常合併）：

• 脛前肌的單核細胞浸潤：對照組為9.0%，四次劑量後為7.3%，六次劑量後為4.7%；只有六次劑量組達到顯著（p = 0.038，每個治療組n = 4，對照為14）。橫膈沒有差異。
• 中央核肌纖維（反覆退化與再生的徵象）：64.3%對82.0%（p = 0.014，n = 5對7）。
• 脛前肌、橫膈或心臟的纖維化沒有減少。
• 握力：296.5 ± 27.2 g對265.7 ± 26.3 g（p = 0.049；標準化為8.6對7.3 g/g，p = 0.002；n = 8對12）。野生型小鼠為336.4 g，因此接受治療的小鼠介於兩者之間。
• 最高跑步速度沒有差異（21.6對20.5 m/min，p = 0.77）。每日跑步距離較長（3,649 ± 1,025對2,420 ± 788 m/day，p = 0.028，n = 8對10），每分鐘平均距離也較長（18.3對14.7 m/min，p = 0.047，n = 5對5）。
• 心臟：整體形態、纖維化或巨噬細胞極化沒有差異，但單核細胞浸潤較少（n = 6對6），左心室縮短分率較高，為37.0 ± 2.3%對33.6%（p = 0.017；野生型為39.6%）。表2的標題列出8隻治療小鼠，而其註腳和圖例說明則寫5隻，這是論文本身的不一致。

結論：

作者的結論是，早期、反覆的全身性hAMSC治療延緩了mdx小鼠的炎症和運動功能衰退，可能是透過M2巨噬細胞極化，而不是細胞變成肌肉。他們提出，這可以與類固醇或基因治療合併使用。

作者說明的限制：

• 與患者相比，mdx小鼠的心臟疾病較輕，因此心臟方面的發現對人類提供的資訊有限。他們提議在狗模型中確認。
• 人類細胞只短暫存續，分泌因子如何產生持久效果尚未確立；機制仍有待釐清。
• 間質幹細胞的長期培養和擴增有老化和染色體變化的風險，免疫抑制能力也依組織來源而異。
• 來自方法部分：研究人員未對品系設盲，部分資料依判斷被排除，長期組的規模小。

背景資訊：

裘馨氏症約每3,500名男嬰中有1人發病。類固醇是標準的抗炎治療，但反應不一，副作用常見。同一團隊先前報告過，反覆靜脈注射牙髓幹細胞，使mdx小鼠和營養不良的狗保持了運動活動。作者指出，經靜脈給予的間質幹細胞大多被困在肺部並在那裡死亡，其免疫效應似乎來自受體自身吞噬細胞對垂死細胞的反應。論文沒有臍帶來源細胞的資料，也沒有提到羊膜來源細胞用於裘馨氏症的人體試驗。