以人類臍帶間質幹細胞進行羊胎兒脊髓脊膜膨出模型產前修補的體內治療：原理驗證研究摘要

主要要點與發現：

這是一項在未出生小羊身上進行的動物研究，沒有治療任何人類。德國漢堡-埃彭多夫大學醫學中心的一個團隊，在胎羊的脊柱上製造脊柱裂（脊髓脊膜膨出）缺損，然後像人類胎兒手術一樣在子宮內修補。在部分小羊中，他們先把人類臍帶間質幹細胞（MSC）直接放在外露的脊髓上。這些細胞來自Desacell，一種以單一健康新生兒臍帶組織製成的即用型產品。先前的羊研究使用的是接種在貼片上的細胞，因此這是第一份以這種方式施放液態細胞懸浮液的報告。

研究顯示，細胞可以施放在預定接受細胞的全部五隻小羊身上。研究無法顯示細胞是否有幫助。七隻接受修補的小羊中只有三隻活產（兩隻治療組，一隻未治療），三隻的動作評分都正常或接近正常，而未治療的小羊存活大型神經細胞的密度反而最高。作者自己也表示，樣本太小，無法做任何組間比較。

目的：

主要目的是測試一種即用型人類臍帶間質幹細胞產品（Desacell）能否在羊的胎兒脊柱裂修補期間局部施放於脊髓。次要目的是觀察細胞是否改善羊運動評分量表（SLR）上的動作、是否增加脊髓及其灰質的大小，以及大型神經細胞密度是否和動作有關。

方法：

研究使用來自單一飼養者的懷孕母羊，所懷的小羊都由同一隻公羊配種。這項研究依德國動物福利法，經漢堡邦政府主管機關核准。

在懷孕約75天時（羊的懷孕期約145天），外科醫師打開子宮，移除L1至L5的皮膚、背部肌肉和脊椎骨弓，並打開覆蓋脊髓的膜。這使脊髓外露於羊水中，模擬脊柱裂。約25天後，小羊接受第二次手術修補缺損。小羊以二比一的比例分配到有細胞或無細胞的修補。在細胞組中，先清除脊髓上方的瘢痕組織，再把含3,000萬個細胞的1 mL Desacell凝膠懸浮液直接施放在脊髓上。所有小羊之後都接受多層貼片和皮膚閉合。在雙胞胎妊娠中，一隻接受治療，另一隻作為對照或不接受手術。

細胞來自一條捐贈臍帶，符合國際MSC身分標準，並經過無菌、黴漿菌和內毒素檢測。細胞經解凍、清洗、計數後，以冷藏（4 °C）方式運送到手術地點。

小羊足月出生，並在出生後2小時和48小時拍攝影片。不知道哪些小羊接受細胞的評估者，以15分制的SLR量表為動作評分，15分是正常行走，0至4分是嚴重障礙。之後小羊被安樂死，腰椎脊髓被切成五到八段，經染色後測量。一位同樣不知分組的神經病理學家，計算每平方毫米灰質中的大型運動神經細胞數。研究開始前，作者計算出三隻和六隻小羊的分組只有25.5%的檢定力，意思是很可能會漏掉真正的差異。

結果：

存活： 在平均76.9天時，於11隻胎羊身上製造了缺損。

• 三隻在第一次手術後失去。一隻母羊出現傷口裂開合併腸阻塞而被安樂死，一隻胎羊在母羊發燒後死亡，另一隻在出現傷口併發症的當天死亡。
• 另有一隻小羊的胎兒無法以手術觸及，因此有七隻小羊接受修補，平均在104.3天時進行。五隻接受細胞，兩隻沒有。
• 另有四隻胎羊在修補後11至17天死亡：五隻治療組中的三隻，以及兩隻未治療組中的一隻。一隻在脊柱處有黴菌膿瘍並合併廣泛黴菌感染。其他死亡的原因不明。
• 三隻小羊在144至147天活產：小羊1（無細胞），以及小羊3和4（有細胞）。論文給出的整體活產率為30%。

動作（SLR量表，滿分15分）：

• 小羊1（無細胞）在2小時時得15分，48小時時得15分。
• 小羊3（有細胞）在2小時時得13分，48小時時得15分。
• 小羊4（有細胞）在2小時時得15分，48小時時得15分。

因此，無論是否接受細胞，三隻小羊在48小時時都能正常行走，所以這些評分無法顯示任何效益。

脊髓組織： 無論肉眼或顯微鏡下，都沒有在任何小羊身上看到腫瘤。

• 未治療小羊的大型神經細胞平均密度為每mm² 20.4個，兩隻治療組小羊為每mm² 15個和13.1個。作者指出，這和先前研究的發現相反。
• 治療組小羊的平均灰質面積較大（274和218單位，未治療小羊為171），灰質佔脊髓的比例為0.32和0.48，未治療小羊為0.31。作者推測這「可能表示組織保存較好」。
• 面積以影像像素測量，沒有報告比較各小羊的統計檢定。

結論：

作者的結論是，在羊的胎兒脊柱裂修補期間施放人類臍帶間質幹細胞產品是可行的，並需要以Desacell進行更大型的研究，測試動作、神經保護和安全性。

這項研究是技術上的第一步。只有一隻未治療和兩隻治療組小羊可以評估，因此結果無法顯示細胞是否有效。作者列出三項主要限制：胎兒死亡率高，使任何有意義的比較都不可能，而且可能反映與細胞無關的手術問題；沒有特殊染色（免疫組織化學），因此無法確認細胞是否仍存在於修補區域；存活者太少，動作評分沒有意義。此外，未治療的小羊也能正常行走，這表示這個模型中的缺損在這些動物身上並沒有造成持久的無力；而且每項比較只有一隻小羊，灰質和神經細胞的差異很可能只是偶然。膀胱功能或脊髓栓繫等長期結果沒有研究，因為小羊只檢查到出生後48小時。

背景資訊：

在歐洲，脊柱裂約影響每2,000例妊娠中的1例。MOMS試驗顯示，在出生前修補缺損，可使需要腦脊髓液分流管的比例減半，並使30個月時能行走的機會加倍，但出生前修補的孩子仍有58%無法獨立行走。研究人員希望在修補時加入幹細胞，能進一步保護外露的脊髓。

細胞產品Desacell被描述為一種以專利分離流程製成的即用型產品。論文沒有指明其製造商或專利持有人。作者表示，它已在囓齒動物和早產狒狒、嚴重肺衰竭的成人（CIRCA-19）、有慢性肺病風險的早產兒（HULC-1）中測試過，並正在敗血性休克成人中研究（UC-CISS II）。他們引用的狒狒研究由共同作者Möbius主導，標題為「Prophylactic administration of mesenchymal stromal cells does not prevent arrested lung development in extremely premature-born non-human primates」（預防性給予間質基質細胞不能防止極早產非人類靈長類的肺發育停滯）。兩位作者來自德勒斯登工業大學薩克森胎兒/新生兒健康中心。

這項研究由德國研究基金會（DFG BA 7308/4-1）資助。作者表示沒有利益衝突。這項工作只是動物實驗，作者指出正在進行的CuRe試驗（使用貼片上的胎盤細胞）是第一項在胎兒脊柱裂修補期間給予幹細胞的人體研究。